HIV-1 Tat基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定

目的:在大肠埃希菌中表达人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)反式激活蛋白(trans activative transcription protein,Tat),为进一步研究可溶性Tat在艾滋病相关卡波氏肉瘤(AIDS-KS)致病过程中的作用提供材料。方法:以本实验室保存的重组质粒pcDNA3.1(+)/Tat101为模板,PCR扩增目的基因Tat。将PCR产物克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-28a(+)-Tat。将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹鉴定后,通过镍亲和层析柱纯化。纯化后蛋白采用虫荧光素酶报告实验进行功能验证。结果:限制性内切酶酶切和基因测序证实,成功构建了含有Tat基因的重组原核表达质粒。蛋白质印迹结果显示,His融合蛋白在大肠埃希菌中得到正确表达,纯化后获得了相对分子质量为18×103的融合蛋白。虫荧光素酶报告实验证实,Tat与HIV-1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)具有结合能力。结论:重组质粒pET-28a(+)-Tat能在大肠埃希菌BL21(DE3)中稳定表达Tat蛋白,镍亲和层析柱纯化的His-Tat融合蛋白具有生物学功能。

Tat基因; 原核表达; 融合蛋白; 人免疫缺陷病毒; 卡波氏肉瘤病毒;

10.13312/j.issn.1671-7783.2013.04.009

R512.91

118308-3125176K
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