IκBα显性负相重组慢病毒载体的构建及其在NF-κB信号通路中的功能验证

目的:构建表达IκBα显性负相结构(dominant-negative construct,IκBα-DN)的重组慢病毒载体,并检测其对核转录因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的影响。方法:PCR扩增IκBα-DN片段并插入至p CDHCMV-MCS-EF1-cop GFP载体中。将构建的p CDH-IκBα-DN重组质粒与包装质粒ps PAX2和包膜质粒p MD2.G共同转染293 T细胞,包装表达IκBα-DN的重组慢病毒,并用梯度稀释法检测病毒滴度。以慢病毒IκBα-DN感染293 T细胞,通过免疫印迹检测IκBα蛋白的表达量。将慢病毒IκBα-DN感染已转染有NF-κB虫荧光素酶报告质粒的293 T细胞,24 h后检测IκBα-DN对NF-κB活性的影响。进一步用慢病毒IκBα-DN感染表达卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的病毒FLICE抑制蛋白(viral FLICE inhibitory protein,v FLIP)的人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),以检测IκBα-DN在NF-κB信号通路中的功能。结果:限制性内切酶鉴定以及核酸序列比对证实重组质粒p CDH-IκBα-DN构建成功。通过三质粒包装系统包装表达IκBα-DN的重组慢病毒,病毒滴度约为3×107efu/m L。以慢病毒IκBα-DN感染293 T细胞,免疫印迹结果表明胞质中IκBα蛋白的表达量明显升高。虫荧光素酶报告实验结果提示,重组慢病毒介导的IκBα-DN能有效抑制NF-κB的活性。在表达KSHV v FLIP的HUVECs中,IκBα-DN也能显著减弱NF-κB通路信号。结论:成功构建的含IκBα-DN序列的慢病毒能够有效地感染293 T细胞和内皮细胞,且初步结果提示IκBα-DN能增加胞质内IκBα的含量,并进一步抑制NF-κB信号的传递。

核转录因子-κB; IκBα; 显性负相结构; 慢病毒; 卡波氏肉瘤病毒;

10.13312/j.issn.1671-7783.y140327

R373

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