IKK2EE重组慢病毒载体的构建及其在NF-κB信号通路中的功能验证

目的:构建含IKK2EE的重组慢病毒载体,并检测其对核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的影响。方法:以真核表达质粒p MIGR1-IKK2EE为模板扩增出IKK2EE基因片段,并将其插入至慢病毒载体p CDHCMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建重组质粒p CDH-IKK2EE。将此重组质粒和NF-κB虫荧光素酶报告质粒共同转染人胚肾上皮细胞(293 T细胞),24 h后检测IKK2EE对NF-κB活性的影响。将重组质粒p CDH-IKK2EE与包装质粒psPAX2和包膜质粒p MD2.G共同转染293 T细胞,包装表达IKK2EE的重组慢病毒,采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。将重组慢病毒感染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),通过免疫印迹法检测IKK2EE以及NF-κB信号通路中相关蛋白的表达,进一步采用免疫荧光法检测NF-κB p65亚基的核定位。结果:质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒p CDH-IKK2EE构建成功。虫荧光素酶报告实验结果显示,IKK2EE能够显著增强NF-κB报告质粒的活性。病毒梯度稀释法测得重组慢病毒滴度约为2×107pfu/m L。重组慢病毒感染HUVECs后,蛋白质印迹结果显示,细胞中磷酸化的NF-κB抑制子(inhibitor of NF-κB,IκB)激酶β(IKKβ)表达升高,IκBα表达下降以及磷酸化的p65表达上升。免疫荧光检测结果表明,重组慢病毒介导的IKK2EE能够显著促进HUVECs中NF-κB p65亚基入核。结论:成功构建了含IKK2EE的重组慢病毒载体,且其能够增强NF-κB信号通路活性。

核转录因子κB; IKKβ; 转染; 慢病毒;

10.13312/j.issn.1671-7783.y150259

R373

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